Detectia mutatiilor in exonii 18, 19, 20, 21 in gena EGFR, in cancerul pulmonar (tesut inclus in parafina)

În paradigma medicinei personalizate, cancerul pulmonar, al cărui cel mai frecvent subtip este NSCLC, rămâne în continuare principala cauză de deces la nivel mondial, în ciuda progreselor constante în diagnostic și în medicina personalizată. NSCLC se caracterizează printr-o varietate de alterări genomice, unele dintre acestea fiind mutații acționabile care servesc drept ținte promițătoare pentru terapii. Identificarea subtipurilor histologice și moleculare ale NSCLC este crucială pentru stabilirea managementului terapeutic, alegerea tratamentului personalizat, îmbunătățirea prognosticului și a calității vieții pacientului. Printre alterările genetice care necesită testare prioritară se numără mutațiile EGFR.

Gena EGFR codifică receptorul factorului de creștere epidermal, o glicoproteină care aparține familiei receptorilor tirozin-kinazici. Este considerată prima genă driver descrisă în NSCLC; mutațiile la nivelul acesteia activează o cascadă de evenimente ce induc proliferarea și supraviețuirea celulară.

Gena EGFR este alcătuită din 28 de exoni, dintre care exonii 18–21 codifică domeniul tirozin-kinazic, regiune la nivelul căreia se produc cele mai frecvente mutații „hot spot”: deleții la nivelul exonului 19 și mutații punctiforme la nivelul exonului 18 (G719X) și 21 (L858R și L861Q), asociate cu sensibilitate la terapia cu inhibitori tirozin-kinazici (TKI), precum și mutația punctiformă T790M și mutațiile de inserție la nivelul exonului 20, asociate cu rezistență la terapia TKI.

Delețiile exonului 19 și mutația L858R reprezintă aproximativ 90% dintre mutațiile activatoare EGFR, fiind asociate cu cel mai înalt grad de răspuns la terapia TKI de primă și a doua generație. Mutația T790M reprezintă cel mai frecvent mecanism de rezistență la terapia TKI de primă și a doua generație, determinând modificări sterice care blochează legarea acestor medicamente la nivelul domeniului kinazic și favorizează progresia tumorală. Pentru pacienții cu NSCLC T790M-pozitiv a fost dezvoltat un nou TKI anti-EGFR, de a treia generație, cu rezultate favorabile în tratamentul bolii. Ca urmare, T790M reprezintă un biomarker prognostic valid la pacienții cu NSCLC tratați cu TKI de primă, a doua și a treia generație.

Testarea mutațiilor EGFR este de importanță crucială pentru stabilirea conduitei terapeutice în cazul pacienților cu NSCLC. În acest scop au fost dezvoltate numeroase tehnologii, precum metoda Real-Time PCR, utilizată în cadrul laboratorului nostru, care permite identificarea corectă și rapidă a celor mai frecvente 29 de mutații ale genei EGFR. Deși pentru aproximativ 30% dintre cazuri nu sunt disponibile probe de țesut tumoral sau calitatea ADN-ului extras din țesut inclus în parafină (FFPE) este inadecvată, biopsia tumorală rămâne abordarea preferată pentru efectuarea testării moleculare.

Afecțiuni și simptome asociate:

Cancerul pulmonar este una dintre cele mai grave și frecvente forme de cancer, adesea detectat tardiv din cauza simptomelor subtile sau absente în stadiile incipiente. Simptomele cancerului pulmonar variază de la o persoană la alta și depind de localizarea tumorii, stadiul bolii și prezența eventualelor metastaze. Deși unele persoane nu prezintă niciun simptom, iar multe dintre simptome pot fi confundate cu alte afecțiuni respiratorii comune (bronșită sau pneumonie), identificarea timpurie este necesară pentru creșterea șanselor de tratament și supraviețuire.

Simptomele specifice cancerului pulmonar includ:

• tuse persistentă (uneori cu sânge);
• durere în piept;
• respirație dificilă sau șuierătoare;
• răgușeală;
• umflarea feței/gâtului.

Alte simptome întâlnite:

• pierderea inexplicabilă în greutate;
• oboseală;
• dureri de spate sau de umăr;
• inflamația ganglionilor limfatici.

Cancerul pulmonar este asociat cu mai multe afecțiuni și sindroame, inclusiv afecțiuni pulmonare preexistente, cum ar fi boala pulmonară obstructivă cronică și boala pulmonară interstițială, care cresc riscul și complică tratamentul. Sindroamele paraneoplazice (complicații mediate imun sau secretoare de hormoni) sunt o consecință a cancerului și includ hipercalcemia, sindromul de secreție inadecvată de hormon antidiuretic și sindroamele neurologice (ex.: sindromul miastenic Lambert-Eaton).

Cui se adresează analiza

Pacienților diagnosticați cu cancer pulmonar de tip NSCLC, în stadiu local avansat sau metastazat, în vederea identificării pacienților eligibili pentru terapii personalizate aprobate de FDA/EMA, conform ghidurilor în vigoare (NCCN, ESMO, ASCO).

Metodologie de testare

Testul presupune extracția ADN-ului din țesut inclus în parafină, cuantificarea acestuia prin metode spectrofotometrice/fluorimetrice în vederea stabilirii calității/cantității și amplificarea sa prin Real-Time PCR.

Beneficii și importanță clinică

Acest test oferă:

• obținerea unui rezultat concret într-un timp relativ scurt;
• posibilitatea evaluării simultane a celor mai frecvente 29 de mutații în gena EGFR, bine caracterizate din punctul de vedere al răspunsului la terapia cu TKI;
• identificarea opțiunilor de tratament compatibile cu profilul tumoral molecular, cu eligibilitate pentru tratament personalizat;
• analiza ADN-ului extras din probe de țesut inclus în parafină (FFPE), utilizând o cantitate redusă de material biologic (2–3 secțiuni de țesut inclus în parafină), ceea ce permite chiar și analiza probelor cu material tisular redus (biopsii obținute prin FNA – fine-needle aspiration);
• obținerea de indicații timpurii privind rezistența la tratament, eliminând astfel toxicitatea unui tratament fără beneficiu terapeutic la care ar fi expuși pacienții non-responderi;
• ghidarea tratamentului antitumoral, pe baza caracterizării profilului molecular, oferind pacienților acces la terapia țintită, cu următoarele beneficii:
• rate mai mari de supraviețuire fără boală (remisii);
• rate crescute de supraviețuire fără progresie (PFS);
• efecte secundare reduse;
• stare generală de sănătate mai bună.

Particularități

Detecția mutațiilor în gena EGFR se realizează prin metoda Real-Time PCR, o tehnică relativ simplă, care prezintă următoarele caracteristici:

• mai puțin costisitoare și cu un timp de analiză mai redus, comparativ cu tehnica NGS;
• sensibilitate crescută – permite amplificarea chiar și a unor cantități reduse de ADN, aspect crucial pentru analiza ADN-ului, adesea limitat, extras din țesut inclus în parafină;
• specificitate crescută pentru mutațiile analizate – permite detecția mutațiilor prezente într-o frecvență redusă în proba tumorală;
• robustețe – permite testarea chiar și atunci când calitatea ADN-ului genomic tumoral este suboptimă, oferind rezultate fiabile pentru probele FFPE, unde predominante sunt fragmentele scurte de ADN;
• limită de detecție scăzută – permite detecția variantelor cu frecvențe alelice mici (1% ADN mutant într-un background de 99% ADN normal), chiar și în biopsii cu conținut tumoral scăzut.

Limitări

• probele de calitate redusă (material tisular insuficient, procent tumoral < 2%, concentrație ADN < 1 ng, ADN degradat/denaturat ca urmare a proceselor de includere în parafină) pot genera date de calitate inferioară, improprii obținerii unui rezultat acurat;
• probele cu rezultat negativ (mutații nedetectate) pot prezenta mutații care nu sunt incluse în acest kit.

Recoltare și condiții

Testul se realizează pe secțiuni de țesut inclus în parafină (FFPE), în general cu grosimea de 5 μm, etalate pe lamă microscopică, fără a fi colorate prin colorația clasică cu hematoxilin-eozină. Medicul anatomo-patolog indică o zonă cu celularitate tumorală crescută, cu zone de necroză, fibroză sau infiltrat inflamator în cantități cât mai reduse, de unde se va efectua extracția de ADN. Testarea genetică pentru detecția mutațiilor în gena EGFR se realizează prin metoda Real-Time PCR.