Detectia mutatiilor in gena BRAF in melanom (5 mutatii in codonul 600: V600E/K/D/R/M) (tesut inclus in parafina)

Melanomul malign reprezintă aproximativ 4% dintre cancerele de piele, iar incidența sa este în continuă creștere în ultimele decenii, în special în populația caucaziană. La nivel mondial, melanomul malign determină aproximativ 80% dintre decesele asociate cancerului de piele.

În etiologia melanomului sunt implicați mai mulți factori de risc:

• factori de mediu – expunerea neprotejată la radiațiile ultraviolete (UV), solare sau artificiale (aparate de bronzat), care deteriorează ADN-ul melanocitelor (celulele producătoare de melanină);
• număr mare de alunițe (nevi pigmentari) – aproximativ 25% dintre melanoamele cutanate derivă din nevi pigmentari;
• istoric familial de melanom – prezent la 5–15% dintre pacienții cu melanom cutanat;
• predispoziție fenotipică – piele deschisă la culoare, sensibilă la expunerea solară;
• factori genetici –
  • mutații germinale în genele CDKN2A și CDK4, implicate în melanomul ereditar (≈10% dintre cazuri);
  • mutații somatice în gene supresoare tumorale și/sau oncogene, responsabile de melanomul sporadic (≈90% dintre cazuri).

În funcție de originea și localizarea primară, au fost descrise patru tipuri principale de melanom: cutanat, acral, mucos și uveal.

Melanomul cutanat reprezintă cea mai frecventă și cea mai agresivă formă, caracterizată printr-o prevalență crescută a mutațiilor somatice, atât în tumora primară, cât și în leziunile metastatice.

Patogeneza moleculară a melanomului implică modificări genetice care determină inițierea, progresia și metastazarea tumorii. Aceste modificări afectează diferite gene driver, care pot fi mutual exclusive în aceeași tumoră – cum sunt mutațiile din genele BRAF și NRAS.

Gena BRAF, componentă-cheie a căii de semnalizare MAP-kinază, codifică o serin-treonin kinază cu rol fundamental în proliferarea tumorală, diferențiere, angiogeneză și metastazare.

Testarea mutațiilor BRAF este esențială pentru stabilirea conduitei terapeutice la pacienții cu melanom. În acest scop, au fost dezvoltate numeroase tehnologii de diagnostic molecular, printre care și metoda Real-Time PCR, utilizată în cadrul laboratorului nostru, care permite identificarea corectă și rapidă a celor cinci mutații (V600E/K/D/R/M) la nivelul codonului 600, exonul 15 al genei BRAF, din probe de țesut tumoral incluse în parafină (FFPE).

Afecțiuni ți simptome asociate

Printre bolile asociate cu risc crescut de melanom se numără:

• Xeroderma pigmentosum;
• Sindromul alunițelor multiple atipice familiale în melanom (Familial Atypical Multiple Mole Melanoma Syndrome);
• Sindromul nevului displazic;
• Retinoblastomul familial;
• Sindromul Lynch tip II;
• Sindromul Li-Fraumeni;
• Boala inflamatorie intestinală;
• Nevii melanocitari congenitali.

Alte afecțiuni asociate melanomului pot fi determinate de metastazele ganglionare (limfadenită), limfedem (umflarea zonei în care melanomul s-a extins la ganglionii limfatici), pierderea în greutate, pete cutanate cu aspect cenușiu (melanoză) și, mai rar, zone depigmentate (hipopigmentări).

Aceste manifestări sunt semne ale progresiei melanomului către stadii avansate și necesită diagnostic și tratament prompt, pentru a preveni evoluția rapidă spre forme severe ale bolii.

Simptomele melanomului incipient

Simptomele melanomului aflat în stadiu incipient sunt descrise prin criteriul ABCDE, care se referă la:

• A – Asimetrie: o jumătate a aluniței nu este similară cu cealaltă;
• B – Margini (Borders): neregulate, șterse sau franjurate;
• C – Culoare: neuniformă, pot exista nuanțe variate de maro, negru, roz sau chiar albastru;
• D – Diametru: leziunea are un diametru mai mare de 6 mm (aproximativ cât guma unui creion);
• E – Evoluție: leziunea își schimbă în timp culoarea, forma sau dimensiunea.

La acestea se pot adăuga: apariția unei alunițe noi, a unei leziuni care nu se vindecă, a unei zone care se înroșește, sângerează sau provoacă mâncărime, precum și simptome specifice melanomului metastatic:

• noduli limfatici măriți sau duri (axilari, inghinali, cervicali);
• dureri osoase sau pierdere inexplicabilă în greutate;
• tuse persistentă sau dificultăți respiratorii (în metastazele pulmonare);
• dureri de cap sau convulsii (în metastazele cerebrale).

Cui se adresează analiza

Testarea mutațiilor BRAF este recomandată pacienților diagnosticați cu melanom malign, în special în stadii avansate sau metastatice, pentru:

• evaluarea eligibilității la terapia țintită cu inhibitori BRAF/MEK;
• aprecierea răspunsului la tratament;
• stabilirea conduitei terapeutice personalizate în funcție de profilul molecular al tumorii.

Metodologie de testare

Testul presupune extracția ADN din țesut tumoral inclus în parafină (FFPE), urmată de cuantificarea acestuia prin metode spectrofotometrice și fluorimetrice, pentru determinarea calității și cantității probei.

Ulterior, ADN-ul este amplificat prin tehnologie Real-Time PCR, metodă care permite detecția calitativă a celor mai frecvente mutații BRAF la nivelul codonului 600 (V600E/K/D/R/M).

Beneficii și importanță clinică

Conform ghidurilor NCCN și ESMO, testarea mutațiilor BRAF este obligatorie la pacienții cu melanom operabil sau inoperabil în stadiul III sau IV și este recomandată, de asemenea, pacienților cu risc crescut de rezecție în stadiul IIC.

Identificarea mutațiilor BRAF atât în nevi, cât și la nivelul tumorilor primare și al leziunilor metastatice sugerează faptul că mutațiile somatice ale genei BRAF reprezintă un eveniment timpuriu în dezvoltarea melanomului.

Astfel, testarea statusului mutațional BRAF a devenit o componentă standard în procedura de diagnostic a melanomului avansat, având implicații majore în alegerea tratamentului, prognostic și monitorizarea evoluției bolii.

Mutațiile somatice BRAF în melanom sunt:

• Hotspot, localizate la nivelul codonului 600 – afectează domeniul kinazic al proteinei BRAF, determinând activarea constitutivă (necontrolată) a acesteia;
• Activatoare, implicate direct în tumorigeneză;
• Acționabile terapeutic – conferă răspuns la inhibitorii BRAF aprobați de FDA;
• Frecvente, fiind identificate la:
  • peste 50% dintre pacienți,
  • 33–47% în tumorile primare,
  • 41–55% în metastaze;
• Mai frecvente la pacienți tineri, cu expunere ocazională la soare;
• Mai agresive comparativ cu melanoamele BRAF wild-type;
• Asociate cu metastaze cerebrale;
• Corelate cu rata redusă de supraviețuire în stadiul IV al bolii.

Clasificarea mutațiilor BRAF

Mutații V600:

• Localizate în exonul 15, reprezentând >90% din totalul mutațiilor BRAF.

V600E – (74–76% din cazuri)

• Asociată cu răspuns crescut la inhibitorii BRAF aprobați de FDA;
• Mai frecventă la pacienți tineri;
• Caracteristică melanomului cutanat;
• Rară în melanomul acral sau mucosal;
• Absentă în melanomul uveal.

V600K – (10–20% din cazuri)

• Asociată cu vârsta înaintată, sexul masculin, localizarea tumorii primare la nivelul capului și gâtului;
• Are o evoluție mai agresivă, risc crescut de metastazare și rata mai redusă de supraviețuire în stadiul IV, comparativ cu V600E.

V600R/D/M – (~6%)

• Mutații mai rare, cu semnificație clinică variabilă.

Mutații non-V600:

• Localizate în exonii 11 și 15, dar în afara codonului 600;
• Rar întâlnite;
• Pot fi rezistente la inhibitorii BRAF de primă generație;
• Impactul lor terapeutic este variabil și necesită corelare cu alte analize moleculare.

Importanța detecției mutațiilor V600 în gena BRAF în melanom

Testarea contribuie la:

• obținerea unui rezultat concret și rapid;
• identificarea opțiunilor terapeutice compatibile cu profilul molecular tumoral;
• stabilirea eligibilității pentru tratamente personalizate cu inhibitori BRAF și BRAF/MEK;
• excluderea terapiei țintite la pacienții BRAF V600 negativi, pentru care sunt necesare alte opțiuni terapeutice.

Particularități tehnice

Detecția mutațiilor în gena BRAF se realizează prin metoda Real-Time PCR, o tehnică precisă și eficientă, care prezintă următoarele avantaje:

• Cost redus și durată scurtă de analiză, comparativ cu tehnologia NGS;
• Sensibilitate crescută – permite amplificarea chiar și a unor cantități reduse de ADN, esențială pentru probele FFPE, unde materialul genetic este adesea limitat;
• Specificitate ridicată – detectează mutații prezente într-o frecvență redusă în proba tumorală;
• Robustețe – oferă rezultate fiabile chiar și în probe cu ADN tumoral de calitate suboptimă, predominante în materialele FFPE (fragmente scurte de ADN);
• Limită de detecție scăzută – permite identificarea variantelor cu frecvență alelică redusă (până la 1% ADN mutant într-un fond de 99% ADN normal), inclusiv în biopsii cu conținut tumoral mic.

Limitări

• Testarea vizează în principal mutațiile V600; mutațiile non-V600 pot necesita teste suplimentare pentru o caracterizare completă a profilului molecular;
• Nu permite detecția tuturor mutațiilor rare ale genei BRAF sau a altor mecanisme de rezistență la terapie;
• Probele cu conținut crescut de melanină sau derivați ai acesteia pot prezenta eșec de amplificare (rezultat neconcludent), melanina fiind un inhibitor al reacției PCR;
• Probele de calitate redusă – material tisular insuficient, procent tumoral <2%, concentrație ADN <1 ng, ADN degradat sau denaturat ca urmare a procesului de includere în parafină – pot genera date de calitate inferioară, improprii obținerii unui rezultat concludent;
• Rezultatele negative (mutații nedetectate) nu exclud prezența unor mutații care nu sunt incluse în kitul utilizat pentru testare.

Recoltare și condiții

Testul se efectuează pe secțiuni de țesut tumoral inclus în parafină (FFPE), cu o grosime de aproximativ 5 microni, etalate pe lamă microscopică fără colorare prin metoda clasică hematoxilină-eozină.

Medicul anatomo-patolog selectează zona cu cea mai mare celularitate tumorală, evitând regiunile cu necroză, fibroză sau infiltrat inflamator, pentru a asigura calitatea optimă a probei de ADN.

Testarea genetică pentru detecția mutațiilor în gena BRAF se realizează prin metoda Real-Time PCR, care permite identificarea rapidă și precisă a mutațiilor punctiforme relevante.

Analize asociate recomandate

• Panel genetic somatic pan-cancer din biopsie lichida - 52 gene
• Panel 52 gene relevante in tumori solide Oncomine Focus Assay ADN + ARN
• Panel genetic somatic melanom [MELA/ N525 + N408]
• Solid tumor panel-Panel genetic somatic tumori solide (149 gene - multiorgan)